細胞凋亡（apoptosis）指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。下面介紹幾種常用的檢測細胞凋亡的方法。

     一、TUNEL法

      脫氧核糖核苷酸衍生物digoxin在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗digoxin抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，精確地定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。洋地黃植物是digoxin的原料來源，在所有動物組織中幾乎不存在能與抗digoxin抗體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗digoxin的特異性抗體與脊椎動物非類固醇激素的交叉反應不到1%，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可*排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡檢測。

      在進行TUNEL法檢測細胞凋亡的實驗中，需設置陽性和陰性對照組，陽性對照的片子可使用DNase I部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松處理的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同?，F在商品化的TUNEL試劑盒很多，可供選擇，除了DAB顯色法，還有熒光標記等方法的試劑盒可以選擇，可根據實驗需求選擇合適的試劑盒來完成細胞凋亡的檢測。

     二、流式細胞儀檢測細胞凋亡

     Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)：

     AO 可將細胞或細胞核中的雙鏈DNA 和變性DNA 染成不同顏色的熒光。AO 插入雙鏈DNA 中時,發綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產生的DNA 單鏈發生作用,這時發出紅色熒光,因此,通過FCM 檢測不同的熒光,可判斷凋亡的發生。在測定被標準化后,綠色和紅色熒光強度的量與總DNA 含量成比例,紅色熒光與總體細胞(紅色加綠色) 熒光的比率表示細胞中變性DNA 的比例,因此,這種方法可用于評價DNA 對原位變性的敏感性。有時候,凋亡細胞DNA 降解不明顯,依賴于DNA 降解來檢測細胞凋亡的方法如細胞DNA含量測定、DNA 末端標記等就難以檢測到細胞凋亡變化。AO法檢測凋亡的原理不依賴于DNA 片斷的產生,因此其最主要的優點是可應用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO 染色法不能有效區分有絲分裂細胞和凋亡細胞。

     若丹明( Rh123) 染色法：

     細胞生活狀態下,胞膜上的鈉- 鉀泵、鈣泵等的作用,使細胞膜內外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成細胞膜電位。FCM 可以檢測親脂性離子熒光染料在胞膜內外的分布,來測量膜電位的高低,以評價細胞的活力。Rh123 是一種親脂性陽離子熒光染料,對細胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細胞存活狀態時,若丹明123 通過細胞膜,積聚于線粒體發出綠色熒光。在細胞凋亡時,線粒體膜的轉運能力下降,電負性降低,故細胞線粒體積聚Rh123 的能力也喪失,熒光強度降低,據此檢測細胞的凋亡變化。但應指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數細胞器和細胞功能相對較好,因此,Rh123 法對于早期凋亡細胞和活細胞的鑒別比較困難。

     Annexin V-PI雙染色法：

     1992 年Fadok 報道在APO 早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin ,PS) 遷移至細胞外側,這一現象出現在核染色質變性與核體積縮小之前。AnnexinV 是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高親合力,尤其與帶負電荷的磷脂如PS 具*的結合力,利用其特性可以檢測細胞凋亡。但壞死細胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 結合陽性,因此使用Annexin V 這一參數不能區分壞死或凋亡,必須同時采用PI 這一參數將壞死細膽區分開來。FCM 通過Annexin V —FITC 標志暴露于細胞膜上的PS 結合PI 進入損傷細胞膜標記降解DNA 分析凋亡與壞死細胞。在檢測時有4個亞群包括機械性損傷細胞(Annexin - / P1 + ) 、正常細胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡細胞(Annexin + / PI - ) 和繼發性壞死細胞(Annexin + / PI + ) 被區分。Boersma 等應用Ampexin V2FITE染色法檢測細胞處理后的中國倉鼠細胞凋亡變化,FCM 檢測發現熒光信號強弱不同的兩種細胞亞群。進一步形態學等證實弱熒光細胞亞群代表早期凋亡細胞,強熒光亞群代表晚期凋亡細胞,可見其是檢測和定量凋亡細胞的一種較為可靠的方法。細胞凋亡時膜上PS 外露早于DNA 斷裂發生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏,且該法不需要固定細胞,避免了PI 法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現的DNA 片段丟失,因此更加省時,結果亦更可靠,是目前最為理想的凋亡定量檢測方法。

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